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Trata-se da segunda expedição de que se tem notícia que conseguiu percorrer todo o leito do rio das Amazonas. Foi realizada no período de 1560 a 1561, sob o comando de Pedro de Urusua, com o objetivo principal de encontrar riquezas. Seu comandante foi morto por Lopo de Aguirre, em uma insurreição efetivada durante a viagem. A expedição chegou ao oceano Atlântico em 1561.
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